La realizzazione del giardino iniziò nel 1549, su progetto di Niccolò Pericoli, detto il Tribolo, su commissione della Duchessa Eleonora di Toledo.

Si decise di iniziare da subito la piantagione di siepi, alberi, piante rare e selvatiche e la costruzione di fontane, in un grande fermento di idee che avrebbe fatto di Boboli uno dei più significativi giardini, degno di una dimora granducale.

Tribolo morì poco dopo l’inizio dei lavori, e la direzione dei lavori passò a Bartolomeo Ammannati e in seguito a Bernardo Buontalenti. Tra i primi interventi di rilievo ci fu la realizzazione della Grotta di Madama, nell’intento di ricreare ambienti naturalistici, popolati da misteriosi esseri e animali di pietra. Sotto la direzione di Bernardo Buontalenti, venne realizzata la grotta grande di Boboli, detta Grotta del Buontalenti.

La grotta fu realizzata con grande effetto scenografico: concrezioni calcaree in forma di stalattiti, conchiglie e rilevi in terracotta, cui l’acqua che scivolava dalle pareti dava vivacità e colore. Con Cosimo II e successivamente col figlio Ferdinando II, Boboli conobbe un aspetto sempre più grandioso.

Sotto la direzione di Giulio Parigi, nel 1612 iniziarono i lavori di espansione del giardino verso Porta Romana.

Il progetto era incentrato tra elementi strutturalmente compositivi focalizzati alla resa prospettica e singoli episodi articolati in successione lungo un imponente viale rettilineo. Quest’ultimo venne chiamato 'Viale dei Cipressi' o 'Viottolone', e costituiva l'asse principale dell'ampliamento. All'ingresso di questo cannocchiale prospettico furono in un primo tempo create due terrazze per la coltivazione degli agrumi, favoriti dall'esposizione a sud. Poi vennero inserite un folto gruppo di ragnaie.

Fra le mura trecentesche e il viale dei Cipressi fu creato anche un grande labirinto a pianta ovale, cui seguì la realizzazione di altri due labirinti, uno in forma ancora ovale nel 1622, l'altro in forma ottagonale nel 1638.

Su progetto di Alfonso e Giulio Parigi, venne ideata la Vasca dell’Isola. L'area della vasca è totalmente circondata da alte siepi di leccio, e da numerose statue di pietra e marmo che raffigurano soggetti mitologici, storici, campestri, popolani. L'isola centrale è accessibile da due passerelle i cui cancelli sono sostenuti da colonne su ciascuna delle quali si trova la statua di un Capricorno, animale simbolo del potere di Cosimo I, e ai lati fontane che versano acqua in conchiglie. L'isola al centro del bacino è circondata da una ringhiera in pietra nelle cui interruzioni sono alloggiati gli orci di terracotta che nei mesi estivi ospitano la collezione di agrumi, ed ha al centro la fontana dell’Oceano, o del Nettuno, del Giambologna. La costruzione della nuova parte del giardino comportò anche il rinnovamento funzionale e tipologico dell'impianto cinquecentesco preesistente retrostante Palazzo Pitti.

Fra il 1631 e il 1637 iniziò la trasformazione dell' Anfiteatro in una struttura permanente, su progetto di Giulio Parigi, creando così un luogo di spettacolo con le gradinate in muratura sormontate e delimitate da nicchie decorate ad arredi scultorei, accanto alla radicale trasformazione del bastione cinquecentesco, praticamente abbattuto per lasciare spazio a collezioni di aranci e spalliere di altri agrumi.

Sotto la manutenzione di Louis Ferdinand de Nesle detto Gervais, la platea dell'Anfiteatro in muratura divenne infatti nel 1740 un parterre de broderie. Con l'insediamento di Pietro Leopoldo di Lorena nel 1765 iniziarono sistematici lavori di restauro nel giardino di Boboli. Il nuovo granduca dispose di realizzare un giardino di specie commestibili rare, attrezzato con couches e serre calde per la coltivazione di piante e frutti esotici sul perimetro del mediceo Orto degli Ananassi, affidandone il progetto a Giuseppe Ruggeri e Niccolò Gaspero Paoletti. Il 28 febbraio 1766 Boboli fu aperto al pubblico, alcuni giorni la settimana ad ogni ordine di persone vestite in modo appropriato. I ragazzi potevano accedervi se accompagnati da adulti.

Era proibito l'accesso a persone di bassa plebe e ai rivenditori, ed erano proibiti alcuni giochi pericolosi per l'incolumità dei luoghi e delle statue. Nelle immagini di Aniello Lamberti si può notare l'alta frequentazione del giardino, con bambini, dame e gentiluomini a passeggio. La Kaffeehaus, un padiglione in stile rococò realizzato da Zanobi del Rosso, era composta da tre volumi, sormontata da una cupoletta 'a cipolla' e con tre terrazze.

Le rampe di accesso, coprivano una piccola grotta e i terrazzamenti erano nella parte inferiore con piantagioni di viti e alberi fruttiferi, e nella parte superiore caratterizzati dal terrazzamento della Fontana del Ganimede con l'Aquila.

Sulle rovine dell'antico serraglio mediceo, presso l'attuale ingresso di Annalena, fu costruito, negli anni 1777-78, il grande 'Stanzone degli Agrumi' o Orangerie, ricovero alle preziose colture, protette nei mesi freddi in un ambiente di raffinata praticità. L'asse più antico, simmetrico alla facciata posteriore di Palazzo Pitti, si allunga verso il colle di Boboli intercettando sul retro dell'edificio l’anfiteatro, al cui centro venne collocato nel 1790 per volontà del granduca Pietro Leopoldo quell’Obelisco Egizio, unico in Toscana, risalente al 1500 a. C. Sotto il governo di Maria Luisa di Borbone, vennero intrapresi nella reggia di Pitti e contemporaneamente in Boboli importanti interventi di ammodernamento di cui fu incaricato Onofrio Boni, nominato nuovo direttore dello Scrittoio delle Fabbriche, che variò le colture "in parte a bosco, a prato, a pomario, a giardino di fiori e di agrumi" nella platea dell'anfiteatro.

Elisa Bonaparte iniziò dal 1809 progressivi lavori in ampie aree, trasformando alcune parti del giardino di Boboli in parco all'inglese.  Ad opera del Cacialli, avvenne lo smantellamento del giardinetto della Spezieria per dare veste definita alla palazzina costruita dal Paoletti, costruendo un nuovo giardino lungo il margine inferiore dell’edificio.

Agli inizi del 1813 la principessa Elisa Bonaparte autorizzò anche lo "slargamento del viale detto d'Adamo ed Eva" , eliminando il corridoio di verzura prima collocato presso il gruppo scultoreo del Naccherino, e tra le mura trecentesche e la limonaia creò una nuova fuga prospettica collocando due filari di platani. Su richiesta di Leopoldo II, avvenne probabilmente l’intervento  più incisivo della storia del giardino, con la sostituzione nel 1834 dei tre grandi labirinti secenteschi con il viale carrozzabile a serpentina, che dalla zona dell'Isola saliva in sommità al Viale dei Cipressi.

Una netta trasformazione del tessuto seicentesco che sostituì il declivio ai terrazzamenti cancellando l'antico disegno e lasciando all'abbandono i boschetti laterali, trasformatisi in leccieta. Un arricchimento importante venne fornito dalla costruzione del nuovo giardino botanico, iniziato nel 1841 sul sito dell'antico jardin potager sotto la guida del grande botanico palermitano Filippo Parlatore.

Qui serre e tepidari garantirono la coltivazione di piante tropicali, esibite secondo criteri di distribuzione geografica, e di varie specie di piante acquatiche in numerose vasche, fra le quali l'Aquarium, un bacino circolare suddiviso in quarantotto celle.

Nel periodo postunitario la trasformazione più significativa di Boboli fu la sistemazione del viale che dal piazzale di Bacco conduceva all'Anfiteatro, realizzata fra il 1890 e il 1891 per volere dell'Amministrazione della Casa Reale.

Da allora il Giardino è rimasto pressoché immutato, salvo l'avvicendarsi di vari restauri conservativi o la sostituzione o l'inserimento alquanto sporadico di nuove specie arboree.